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SYBR Green I 染料法qPCR预混液

SYBR Green I 染料法qPCR预混液

简要描述:SYBR Green I 染料法qPCR保存条件: - 20 ℃避光长期储存;4℃避光存放6个月。
产品介绍:
本品为SYBR Green I 染料法qPCR预混液。该预混液包含qPCR所需的酶、dNTP、缓冲液、荧光染料、参比染料等组分,使用
时只需加入模板、引物、水即可,简便易用。其中本品所使用的聚合酶采用了配体热启动技术,较之抗体封闭、化
学修饰等热启动方式具有封闭效率高,酶活释放快的优势。

产品型号: Q204-01

所属分类:PCR 试剂

更新时间:2021-08-06

详细说明:

SYBR Green I 染料法qPCR预混液

2 x S6 Universal SYBR qPCR Mix
货 号: Q204
SYBR Green I 染料法qPCR预混液保存条件: - 20 ℃避光长期储存;4℃避光存放6个月。
产品介绍:
本品为SYBR Green I 染料法qPCR预混液。该预混液包含qPCR所需的酶、dNTP、缓冲液、荧光染料、参比染料等组分,使用
时只需加入模板、引物、水即可,简便易用。其中本品所使用的聚合酶采用了的配体热启动技术,较之抗体封闭、化
学修饰等热启动方式具有封闭效率高,酶活释放快的优势。搭配针对qPCR精心优化的缓冲体系,该预混液具有灵敏度高,特异
性强、定量范围广、重复性好的特点。另外本品预混了特殊的ROX参比染料,可兼容所有qPCR仪器,无需针对不同仪器额外
添加相应的ROX。
产品组成:
组分 Q204-01
2× S6 Universal SYBR qPCR Mix 4 x 1.25 mL
温馨提示:
·本品已预混适用所有qPCR仪器的ROX参比染料,无需额外添加ROX;
·若解冻后管底出现白色或淡红色沉淀,请颠倒混匀确保沉淀完全溶解后使用;
·本品含有荧光染料SYBR Green I,使用和存储时请避免强光照射;
·配置反应液时,请使用灭菌枪头、Microtube等,同时避免产生气泡;
产品使用:
A.推荐反应体系
2 × S6 Universal SYBR qPCR Mix 在冰上解冻后,混匀,按如下顺序加样:
2 x S6 Universal SYBR qPCR mix 10 μL
Primer-F (10 μM) 0.4 μL
Primer-R (10 μM) 0.4 μL
Template x μL
ddH 2 O 补足至 20 μL
注:引物和模板使用量请根据需要调整,引物的终浓度范围在0.1-1 μM,通常引物的使用量增加可以提高灵敏度(Ct减小)但同时会降低特异性(出现引物二聚
体等非特异性产物);未稀释的cDNA的加入量不应超过总反应体积的1/10;使用DNA作模板时,请勿加入过量DNA(<500ng)以免产生背景信号。
B.推荐反应程序
阶段 温度  时间 循环数
预变性 95℃ 30秒 1
变性 95℃ 3-10秒
退火&延伸 60℃ 10-30秒
融解曲线 使用仪器默认程序即可
注:预变性温度和时间可以根据模板复杂度进行调整,如模板复杂度较高可以提高预变性温度并延长时间;对于长度小于200bp的扩增子,可以使用快速程序,即
变性时间3秒,退火和延伸时间10秒;对于长度大于200bp的扩增子,请延长退火和延伸时间至30秒。对于高GC的扩增子,可提高退火延伸温度至65℃;循环数设
置为40-45可满足绝大多数的反应;对于Tm较低的引物,可使用三步法,比如退火温度设置在55℃,延伸温度设置为72℃,信号采集设置在延伸步骤。
常见问题及解决方案:
问题
无扩增曲线
复孔重复性差
融解曲线不是单峰
标准曲线线性关系不佳
与其他qPCR试剂相比,Tm
值不同
是否需要冰上操作
是否兼容快速程序
可能原因
缺少qPCR反应必需组分
反应程序设置不正确
试剂存在污染或过期
模板或引物存在降解
模板投入量过低
加样时带入了PCR抑制物质
模板浓度较低,加样
管材封闭性存在问题
组分没有充分混匀
PCR管中存在气泡
出现Tm值低于目的产物Tm值的融
解峰,低Tm值的峰一般为引物二
聚体
出现Tm值高于目的产物的Tm值的
融解峰,一般认为是过度扩增造成
使用cDNA存在基因组污染或
mRNA存在可变剪切
极少数目的产物过长会分段解链
形成双峰
出现明显异常的点(加样或仪器不
稳定造成)
标准品降解
反应液中引入了抑制物
NTC存在污染
低模板量加样存在误差
不同厂家的buffer使用了不同的盐
离子浓度
解决方案
确认是否加入适当的模板和引物
确认选择FAM/SYBR的检测通道;确认信号采集设
置正确,两步法设置在退火延伸步骤,三步法设置
在延伸步骤
更换新的试剂
更换新的模板或引物
适当提高模板投入量
通常抑制剂是模板纯化时残留的物质,该情况可通
过稀释模板缓解;必要时可进一步纯化模板
请避免加入小体积的低浓度模板,该情况下可以进
一步稀释模板后加入大体积
上机前请确认PCR管已被封闭好,必要时更换管材
请确保mix被充分混匀
请避免出现气泡
通过NTC(不加模板的control)确认,NTC如出现
同样Tm值较低的融解峰则可确认为由引物二聚体
引起。可通过提高退火温度,重新设计引物解决(
避免上下游引物3’端互补配对)
可通过降低模板投入量,减少退火延伸时间解决
使用DNaseⅠ处理模板或跨内含子设计引物;更换
可以区分可变剪接的引物。
除非必要,请尽量将扩增子的长度控制在70-200bp
的范围
剔除异常点进行计算
更换新的标准品
找到抑制物来源,更换相应组分
更换试剂及实验环境(可在紫外灭菌后的超净台操
作)
进一步稀释低浓度模板后加入大体积
内参基因和目的基因使用同一品牌试剂即可进行相
对定量,Tm值没有比较参考价值的。
本品含有配体法热启动Taq DNA Polymerase可避
免室温下引物的非特异性延伸,可以常温配置体系
扩增子在70-200bp时可使用快速程序,根据不同仪
器可以节省40%-60%的时间,扩增子>200bp时,
请使用标准程序




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